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细胞外囊泡概述以及在整形相关疾病中的基础研

发布时间:2019-10-06

  作者:赵芳宁、罗赛、崔煜煜、郑杨等,哈尔滨医科大学附属一院 整形美容中心

  细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)是由细胞释放的 各种具有膜结构的囊泡结构统称。根据其直径不同,可分为 4 个亚群:外泌体、微粒和凋亡小体和癌小体(oncosomes)。外 泌体(exosomes)直径为 30~150 nm;微粒也叫核外颗粒体(microvesicles/ectosomes),直径为 100~1 000 nm;凋亡小体(apoptotic body/bleb) 是细胞凋亡过程中产生的直径约为 50~5 000 nm 的囊泡;癌小体是最新发现的类别,直径为 1~10 μm,已 在癌细胞中观察到[1]。目前研究热点是外泌体这个亚群。

  2.1 外泌体概述 外泌体密度为 1.11~1.19 g/ml,电镜下有 典型的“盘样”结构,呈扁平的球体形。其英文名称并不是 exosome,exosome 这个词在 1997 年被用做称呼提取 RNA 过程中的一个多重核酸酶复合物。外泌体几乎可由所有种类 的细胞分泌,并存在于人体各种体液之中,包括血液、尿液、 唾液、乳汁、脑脊液、羊水、腹水、汗液以及月经血。最近的研 究表明[2],在牛奶中也发现了外泌体。1983 年,外泌体被发现 存在于体外培养的绵羊 RBC 培养基上清液中,但研究者一 直认为其只是细胞的一种废弃物。然而有研究发现(H Valadi,2007 年),这种微小囊泡中含有特异的蛋白、脂质和核 酸,能作为信号分子传递给其他细胞,从而改变其他细胞的 功能。这些发现, 激发了人们研究 EV 的热情。

  2.2 外泌体的合成过程 外泌体的许多重要功能与其独特 的形成机制有关[3]。首先细胞膜向内出芽,胞内物质会通过核 内分选系统复合物 (endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)形成早期核内体,核内体仍然向内出芽,在 一些脂类、蛋白质的帮助下,分选货物后形成多泡体(multi-vesicular body, MVB)。一部分 MVB 与溶酶体融合后裂解, 另一部分将会在 Rab27a、Rab27b 以及 Snare 蛋白的帮助下 与质膜融合,并释放其内容物到细胞外,这些内容物就是外 泌体[4]。而微泡则将直接与质膜融合, 这个过程叫做向外出芽。

  2.3 外泌体的组成成分 外泌体的细胞骨架成分包括肌动 蛋白、微管蛋白;可以运输和融合很重要的蛋白质,如膜联蛋 白和脂筏蛋白;参与细胞靶向的四跨膜蛋白;参与 MVBs 的 生物合成抗体 Alix 和 TSG101;提供结构稳定性的胆固醇、 神经酰胺、磷酸甘油酯;以及整合素 CD9、CD63、CD81 和与 免疫相关的参与抗原结合和呈递的 MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子。外 泌体还能携带可以在细胞之间转移的功能性 mRNA 和 miRNA。除含有 RNA 外,肿瘤释放的微泡还含有单链 DNA、基 因组 DNA、cDNA 和转座因子[5]。这些重要的发现提示了外 泌体作为疾病的生物标志物等具有的多方面作用[6]。

  2.4 外泌体的提取及检测方式 外泌体的常见提取方法主 要有:差速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠 法、色谱法、试剂盒法,以及声学镊子等[7]。但最常用的还是差 速离心法。为了获得更好的 EV 或 EV 亚型分离特异性,大多 数研究人员在完成主要步骤后再使用一种或多种其他技术, 因此多种提取技术的组合可能会达到比传统方法更好的分 离效果或特异性。对外泌体的鉴定方式主要是通过电子显微 镜技术观察其特异性“盘样”结构、使用 NanoSight 分析来测 量粒度分布情况,以及蛋白质印迹显示一些外泌体标记物, 例如 CD9 和 CD63。

  目前,EVs 的功能还没有被完全阐明。已有报道认为,他们 能够参与疾病的病理过程, 同时在正常的生理过程中也发挥着 重要功能。EV 在整形外科相关疾病中也有应用前景,主要是因 为他们能够以旁分泌或内分泌的方式起作用,从而改变相邻 细胞或远处细胞的行为,对组织修复和创面愈合有一定作用; 他们还含有丰富的生物标志物,可用于早期诊断黑色素瘤及 基底细胞癌等疾病;且由于其具有独特的合成功能及对受体 细胞的作用, 通过它可了解肥胖与衰老的生理和病理特点。

  3.1 促进伤口愈合与抑制瘢痕形成 伤口愈合是一个复杂 的动态过程,主要涉及 4 个阶段,即凝血、炎症、增殖和重 塑(Heng MC,2011 年)。EV 能调节各个阶段从而促进伤口 愈合并且抑制瘢痕形成。在凝血阶段,于各类细胞的 EV 质 膜上发现凝血激活剂 TF,如巨噬细胞[8]以及血小板。在体外研究中发现,含有 TF 与凝血因子Ⅶ相关的唾液 EV 显著降低 了人体伤口血液的凝血时间[9]。随后的炎症阶段, EV 通过减 少白细胞和血清的数量控制炎症反应。人间充质干细胞 (mesenchymal stem cells,MSCs)分泌的 EV 通过减少嗜中性 粒细胞的数量和抑制巨噬细胞向损伤部位的募集,并通过促 巨噬细胞极化为 M2 型来调节炎症[10]。 增殖环节已证明,受到多种细胞类型的 EV 调节,如脐 带来源 MSCs[11]、 滑膜 MSCs[12]、 ADSCs 等。这些细胞的 EV 可 激活 Akt 和 Erk1/2 通路,促进内皮细胞增殖[13],并通过热休 克蛋白(heat shock protein,HSP)家族成员,如 HSP70 和 HSP90 促进成纤维细胞向伤口部位的迁移和血管形成(Mccready J,2010 年)。脐带来源的 MSCs-EV 可分泌 miR-21-3p 激活 Wnt4/Wnt-β 连环蛋白通路增强该环节[14]。 最后在重塑阶段,人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs) [15]、 ADSCs 分泌的 EV 可以下调Ⅰ、Ⅲ 型胶原蛋白的表达、调整 TGF-β3:TGF-β1 和 MMP3: TIMP1 的比例[16],上调 ECM 的结构蛋白 COLⅠ和Ⅲ,促进 ECM 重建 [17]。并且 MSCs-EV 携带的 miRNA,如 miR-21, miR-23a 和 miR-145 抑制了 TGF-β/SMAD2 信号传导途径 通路的活性,从而抑制伤口附近肌成纤维细胞的增殖和活 性,抑制瘢痕形成[18]。 FHE 水凝胶,是由普朗尼克 F127(pluronic F127,一种加 聚物)、聚 -ε-L- 赖氨酸(poly-ε-Llysine,EPL)和透明质酸(oxidative Hyaluronic acid,OHA)组成,其可以传递并释放具有 生物活性的脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells, AMSCs)分泌的 EV,具有自我修复、 抗菌的特性。FHE 水 凝胶的多功能水凝胶为修复慢性伤口提供了一种新方法[19], 应用水凝胶来递送 EV 以促进血管形生成、伤口愈合,将是 未来整形外科的探索方向。

  3.2 肥胖 Ferrante 研究发现[20], 除脂肪细胞外,脂肪组织中 还含有许多免疫细胞,包括大量的巨噬细胞,脂肪细胞的 EV 会被巨噬细胞摄取。标准饮食小鼠的脂肪组织由 M2 型巨噬 细胞群体主导,其脂肪组织的 EV 分泌的 miRNA 能介导脂 肪细胞、免疫细胞和代谢器官之间的信号和营养物的交换, 从而有助于其体内的全身代谢稳态。但肥胖破坏了这种平 衡,高脂肪饮食小鼠脂肪细胞释放的 EV 分泌的 miRNA-34a 在脂肪组织中的表达逐渐增加,其抑制巨噬细胞从 M1 到 M2 的变化从而诱导脂肪炎症[20], “发炎的”脂肪组织是与肥 胖相关的全身性低度炎症的主要原因。当高脂肪饮食的小鼠 脂肪组织来源的 EV 放到标准饮食的小鼠体内时,主要被外 周血单核细胞吸收,2018开奖历史,促进细胞因子释放和巨噬细胞活化,导 致全身性胰岛素抵抗[21]。 虽然在这项研究中并未发现小鼠的体质量有明显变化, 但 揭示了一种细胞间通讯和营养交换形式,香港管家婆玄机彩图在广西各地举办的一系列国际级比赛、国家级比, 对阐明肥胖相关的病 症机制具有重要意义。如果能进一步了解脂肪组织 EV 的生理 和病理生理,将使 EV 治疗慢性肥胖相关疾病成为可能[22]。

  3.3 黑色素瘤以及基底细胞癌 越来越多的研究表明,外泌 体在生理和病理生理条件下从各种组织释放,并携带信号分 子,用于对细胞间通讯和器官功能的调节,并可以改变细胞和器官功能,因此被认为是疾病的生物标志物及预后指标[23]。 黑色素瘤是致命的皮肤癌之一,黑色素瘤细胞可分泌几 种 EV。在早期的黑色素瘤以及基底细胞癌中,可以通过液体 活检的方式来检测与癌症相关 EV 内容物,做到早期诊断, 且在疾病的进展中也能发现是否存在转移以及判断疾病预 后情况。EV 可能作为潜在的癌症疫苗[24]。

  3.4 衰老 衰老是身体局部和整体功能退化的结果。Zhang 等[25]制作的动物模型中,小鼠开始衰老时下丘脑神经干细 胞(hypothalamic neural stem cells,htNSC)大量丧失,主要以 核转录因子 Sox2 和核蛋白 BMI1 为主[25], 从而在肌肉耐力、 协 调性、踏板运动、认知等方面出现衰老症状。因此认为, htNSCs 的丧失是全身衰老的重要原因,而 htNSCs 主要由 EV 分泌的 miRNA 调控[26]。如果将用 htNSCs-EV 注射于 11 个 月龄以上小鼠体内,可观察到衰老速度减缓以及因衰老出现的 症状改善。 同样有研究发现,衰老过程中 NAD+ 在循环系统中的水 平随着年龄的增长在小鼠和人类中显著下降。输入新生小鼠 的血液可以延长老年小鼠的寿命及改善健康状态,这主要是 由血液中 EV 携带的细胞外烟酰胺磷酸核糖转移酶(extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase,eNAMPT)增 强 NAD+ 的生物合成,从而延长了小鼠的寿命[27]。 皮肤光老化是人体衰老的最直接表现,主要是由于紫外 线照射后导致基质金属蛋白酶 MMP 异常上调,致真皮基 质合成与降解之间不平衡。用源自 ADSCs 的 EV 治疗后会 显著抑制紫外线 的过表达,并增 强Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型胶原蛋白和弹性蛋白的表达。研究证明,富 含 ADSCs-EV 的多种成分可以促进皮肤光老化恢复[28]。

  目前细胞外囊泡在临床应用中尚存在一些技术挑战。由 于缺乏广泛适用的方法来分离和验证各个 EV 亚型的同质 样本,因此可能导致分离物在不同程度上由多种 EV 亚型组 成,并且还可能含有非 EV 成分,如蛋白质、铁拐李论坛四是稳步推进城镇棚户区改造。,病毒和细菌[29];此 外,缺乏隔离协议的标准化和不能使协议适应各个实验室可 用的设备(转子类型、离心时间和施加的外力)可能导致差异 进一步增大和出现不一致(Cvjetkovic A,2014 年)。同样, 可 用于检测和鉴定 EV 的技术也是变化的,并且他们的准确度 和精确度以及测量的特定参数也不同[30]。 从事细胞外囊泡研究的科学家们需要将用于分离和检 测 EV 的技术标准化,并将实验程序与国际细胞外囊泡学 会(ISEV)提出的指南[31]进行对比。 EV 在促进伤口愈合、抵制 瘢痕形成、延缓衰老以及治疗肥胖、黑色素瘤和基底细胞癌 等方面的前景,取决于该领域最佳的实验方法与研究,并在 临床实践中不断开拓创新。

  来源:赵芳宁、罗赛、崔煜煜、郑杨等,细胞外囊泡概述以及在整形相关疾病中的基础研究进展[J],中国美容整形外科杂志,2019,30(8):509-511.



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